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Generación de embriones bovinos transgénicos mediante un procedimiento de transgenesis mediada por espermatozoides [recurso electrónico] / Pía Francesca Loren Reyes ; profesor guía : Ricardo Nicolás Felmer Dörner

Por: Colaborador(es): Idioma: Español Temuco (Chile) : Universidad de La Frontera , 2012Descripción: vii, 63 hojas : figurasTipo de contenido:
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Tema(s): Nota de disertación: Tesis : (Biotecnólogo).-- Universidad de La Frontera, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Medioambiente, 2012. Resumen: La transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la capacidad intrínseca que poseen los espermatozoides para unir ADN exógeno, lo que ha permitido en algunas especies la generación de embriones y animales transgénicos, luego de la fecundación de ovocitos con espermatozoides incubados con el transgén. Aunque la SMGT ha sido utilizada en diferentes especies, los resultados dispares y las dificultades observadas en la reproducibilidad de esta técnica sumada a la baja eficiencia de integración del ADN en el genoma del animal, ha impedido una mayor adopción de esta tecnología. De esta forma, el objetivo del presente estudio fue implementar un método de transgénesis mediada por espermatozoides en la especie bovina. Para ello, se realizaron 2 experimentos independientes: (1) fecundación in vitro convencional y (2) fecundación in vitro modificada e inyección citoplasmática del marcador de fluorescencia. En ambos casos se utilizaron ovocitos procedentes de ovarios de matadero, madurados en medio TCM-199 durante 24 horas a 38,5 °C, 5% CO2 y humedad a saturación. Para la FIV convencional se co-incubaron ovocitos durante 18 h con 1x106 espermatozoides/mL tratados previamente (0,001 ?g/?L por 30 y 60 min; 0,01 ?g/?L por 30, 60 y 120 min; 0,04 ?g/?L por 30 y 60 min; y 0,16 ?g/?L por 30 y 60 min, para pIRES-EGFP y pHcRed). En el caso de la FIV modificada, se co-incubaron ovocitos con 1x106 espermatozoides/mL durante 13 horas. Los presuntos cigotos fueron denudados y microinyectados con aproximadamente 10 pL de una solución de 5% PVP conteniendo pHcRed (50 y 250 ng/?L). En ambos experimentos, los embriones fueron cultivados en medio KSOM-0,4% BSA, a 38,5 °C en atmósfera de baja tensión de O2 y humedad a saturación. Los resultados mostraron que la incubación de espermatozoides bovinos con ADN plasmidial previo a la fecundación in vitro, no generó embriones transgénicos en ninguno de los tratamientos evaluados, lo que se evidenció por la ausencia de expresión de las proteínas fluorescentes. Por el contrario, la inyección citoplasmática de ADN posterior a la fecundación in vitro permitió generar embriones transgénicos con una alta eficiencia (38%), lo cual se evidenció por la fluorescencia observada en sus blastómeras a las 72 h de cultivo. Al evaluar la fluorescencia al día 7, sólo los blastocistos generados mediante la inyección con 250 ng/?L de pHcRed-nuc expresaron el marcador de fluorescencia (18%). Aunque el método de inyección citoplasmática de ADN requiere aún de mayor estandarización, su alta eficiencia comparado con el método tradicional de transgénesis mediada por espermatozoides, sugiere su potencial como un nuevo método para generar animales transgénicos.
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Tipo de ítem Biblioteca actual Colección Signatura topográfica Copia número Estado Fecha de vencimiento Código de barras
Tesis y proyectos de título Biblioteca Central Estantería Tesis y trabajos de título BIO L868g 2012 (Navegar estantería(Abre debajo)) c.1 No para préstamo 35605002306644

CD-ROM contiene tesis digital en formato PDF (1.69 MB)

Incluye índice de materias, figuras, cuadros.

Tesis : (Biotecnólogo).-- Universidad de La Frontera, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Medioambiente, 2012.

Bibliografía: hojas 41-53.

La transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la capacidad intrínseca que poseen los espermatozoides para unir ADN exógeno, lo que ha permitido en algunas especies la generación de embriones y animales transgénicos, luego de la fecundación de ovocitos con espermatozoides incubados con el transgén. Aunque la SMGT ha sido utilizada en diferentes especies, los resultados dispares y las dificultades observadas en la reproducibilidad de esta técnica sumada a la baja eficiencia de integración del ADN en el genoma del animal, ha impedido una mayor adopción de esta tecnología. De esta forma, el objetivo del presente estudio fue implementar un método de transgénesis mediada por espermatozoides en la especie bovina. Para ello, se realizaron 2 experimentos independientes: (1) fecundación in vitro convencional y (2) fecundación in vitro modificada e inyección citoplasmática del marcador de fluorescencia. En ambos casos se utilizaron ovocitos procedentes de ovarios de matadero, madurados en medio TCM-199 durante 24 horas a 38,5 °C, 5% CO2 y humedad a saturación. Para la FIV convencional se co-incubaron ovocitos durante 18 h con 1x106 espermatozoides/mL tratados previamente (0,001 ?g/?L por 30 y 60 min; 0,01 ?g/?L por 30, 60 y 120 min; 0,04 ?g/?L por 30 y 60 min; y 0,16 ?g/?L por 30 y 60 min, para pIRES-EGFP y pHcRed). En el caso de la FIV modificada, se co-incubaron ovocitos con 1x106 espermatozoides/mL durante 13 horas. Los presuntos cigotos fueron denudados y microinyectados con aproximadamente 10 pL de una solución de 5% PVP conteniendo pHcRed (50 y 250 ng/?L). En ambos experimentos, los embriones fueron cultivados en medio KSOM-0,4% BSA, a 38,5 °C en atmósfera de baja tensión de O2 y humedad a saturación. Los resultados mostraron que la incubación de espermatozoides bovinos con ADN plasmidial previo a la fecundación in vitro, no generó embriones transgénicos en ninguno de los tratamientos evaluados, lo que se evidenció por la ausencia de expresión de las proteínas fluorescentes. Por el contrario, la inyección citoplasmática de ADN posterior a la fecundación in vitro permitió generar embriones transgénicos con una alta eficiencia (38%), lo cual se evidenció por la fluorescencia observada en sus blastómeras a las 72 h de cultivo. Al evaluar la fluorescencia al día 7, sólo los blastocistos generados mediante la inyección con 250 ng/?L de pHcRed-nuc expresaron el marcador de fluorescencia (18%). Aunque el método de inyección citoplasmática de ADN requiere aún de mayor estandarización, su alta eficiencia comparado con el método tradicional de transgénesis mediada por espermatozoides, sugiere su potencial como un nuevo método para generar animales transgénicos.